氫氧化鈉甲醇溶液：需現配現用，避免甲醇揮發導致溶液濃度降低，影響皂化效果；配制時注意防護，甲醇具有揮發性和毒性，操作需在通風櫥內進行。

三氟化硼甲醇溶液：該試劑具有強腐蝕性和刺激性，添加時需緩慢從回流冷凝器上端加入，防止濺灑；試劑需密封避光保存，避免失效。

正庚烷：必須使用色譜純，防止雜質干擾后續氣相色譜檢測；加入量需根據樣品中脂肪酸含量調整，確保甲酯化產物被充分萃取。

無水硫酸鈉：使用前需經高溫烘烤（550℃，2h） 除水，否則會因殘留水分導致萃取液渾濁，影響檢測；加入量以能完全吸附水分、使溶液澄清為準。

皂化溫度：嚴格控制水浴溫度為 80℃±1℃，溫度過低會導致皂化不完全，油滴無法消失；溫度過高則可能引起甲醇劇烈揮發，造成試劑損失。

皂化終點判斷：以 “油滴完全消失” 為標準，不可提前停止回流，否則未皂化的油脂會無法參與后續甲酯化反應，導致結果偏低。

甲酯化時間：加入三氟化硼甲醇溶液后，需精準回流 2min，時間過短甲酯化不充分，時間過長可能導致部分脂肪酸甲酯分解。

回流裝置密封性：安裝回流冷凝器時需確保接口緊密，防止甲醇蒸汽泄漏，既保證試劑用量準確，也避免實驗室環境污染。

冷卻步驟要求：皂化 - 甲酯化完成后需迅速冷卻至室溫，高溫下正庚烷的萃取效率會下降，且可能增加甲酯化產物的揮發損失。

振搖操作規范：加入正庚烷后需劇烈振搖 2min，使有機相和水相充分接觸，但振搖時需注意泄壓，防止燒瓶內壓力過高；靜置分層時需保證分層完全，避免水相混入正庚烷萃取液。

分液與轉移要點：吸取上層正庚烷溶液時，需用移液管緩慢吸取，避免吸到中間乳化層或下層飽和氯化鈉水溶液；轉移至進樣瓶后需及時密封，防止溶劑揮發和樣品污染。

所有操作需在通風櫥內進行，佩戴耐有機溶劑手套、護目鏡和實驗服。

三氟化硼甲醇溶液若不慎接觸皮膚，需立即用大量流動清水沖洗 15min 以上；甲醇易燃，實驗過程中需遠離明火。